Evaluarea activității biologice a menadionei utilizând celule defecitve in Cu/Zn Superoxid dismutază
Coordonatori:
Asist. dr. Nicolau Ioana Conf.dr.Fărcășanu Ileana Absolvent: ZACHE Alexandru
BUCUREȘTI
2013
Cuprins
I.1 Introducere .................................................................................................. 4
I.1.1 Proteinele.....................................................................................................4
I.1.1.1 Structura proteinelor.................................................................................4
I.1.1.2 Denaturarea proteinelor............................................................................9
I.2 Informații generale despre superoxid dismutază......................................9
I.2.1 Importanță medicală................................................................................14
I.2.1.1 Superoxid dismutaza în tratamentul cancerului......................................15
I.2.1.2Superoxid dismutaza în artrita reumatoidă...............................................16
I.2.2 SOD mimetici.............................................................................................17
I.3 SOD în Saccharomyces cerevisiae...............................................................18
I.4 Menadiona....................................................................................................19
I.5 Scopul lucrării..............................................................................................20
II.1. Considerații generale.................................................................................20
II.1.1 Aparatură și ustensile................................................................................20
II.1.2. Linii celulare folosite................................................................................21
II.1.3 Medii de cultură.........................................................................................21
II.2 Electroforeza...............................................................................................22
II.2.1 Prepararea soluțiilor de acrilamidă.........................................................23 II.2.2.Prepararea soluțiilor tampon...................................................................24 II.2.3. Prepararea și aplicarea gelurilor..........................................................25
II.2.4 Pregătirea cuvei de electroforeză şi aplicarea probelor.........................28
II.2.5.Prepararea soluțiilor de colorare a gelurilor.............................................29
II.3 Rezultate.....................................................................................................29
II.3.1 Screening-ul genomic...............................................................................29
II.3.2 Screening în diluții seriale........................................................................32
II.3.3 Electroforeza............................................................................................34
Concluzii............................................................................................................35
Capitolul 1. Partea teoretică
I.1 Introducere
I.1.1 Proteinele
Proteinele1 sunt biomolecule mari alcătuite dintr-unu sau mai multe lanțuri de aminoacizi. Secvența liniara a aminoacizilor legați între ei prin legături peptidice conțin informația necesară pentru a genera o moleculă de proteină cu o structura tridimensională unică. Ele sunt prezente în celulele tuturor organismelor vi în proporţie de peste 50% din greutatea uscată. Toate proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor, iar secvenţa acestora este codificată de către o genă.
Complexitatea unei proteine este determinată cel mai bine considerând molecula din punctul de vedere al celor patru tipuri de structuri: primară, secundară, tertială și cuaternală din care este formată. Acestea au un rol important în menținerea integrității celulare, reglarea proceselor biochimice, transportul de-a lungul membranelor, etc. I.1.1.1 Structura proteinelor.
Structura primară
Este constituită din secvența de aminoacizi dintr-o proteină. Înțelegerea structurii primare a proteinelor este importantă deoarece multe boli genetice provin de la proteine cu o secvență de aminoacizi anormală ce cauzează plierea necorespunzătoare a proteinei și pierderea sau deteriorarea unor funcții. Dacă structurile normală si mutantă ale proteinei s-ar cunoaște boala ar putea fi vindecată.
Structura primară a proteinelor. Preluare de pe www.click4biology.info A. Legături peptidice.
În proteine, amino acizii sunt legați între ei covalent prin intermediul legăturilor peptidice ce reprezintă legături amidice între grupările -carboxilice ale unui amino acid cu grupările -aminice ale următorului amino acid. Legăturile peptidice nu pot fi rupte de către aceleași condiții ca în cazul denaturării proteinelor cum ar fi încălzirea, concentrații mari de uree, etc. Expunerea prelungită a acestora la acizi și baze tari la temperaturi înalte este encesară pentru hidrolizarea nonenzimatică a legăturilor. B. Determinarea structurii principale ale unei proteine prin secvenționarea ADN-ului.
Secvența de nucleotide dintr-o regiune codificatoare a ADN-ului specifică secvența de amino acizi ai unei polipeptide. Așadar, daca putem determina secvența de nucleotide, este posibil, prin cunoașterea codului genetic să deducem secvența corespunzătoare de amino acizi. Acest procedeu este limitat de fapul că nu poate da informații în legatură cu poziția legăturilor bisulfidice și nu identifică amino acizii ce au fost modificați după încorporarea lor în polipeptide.
Structura secundară
Lanțurile polipeptidice ce ascătuiesc structura primară nu iau structuri tridimensionale aleatorii, ci formează aranjamente regulate. Aceste aranjamente reprezintă structura secundară a lanturilor polipeptidice. α-helix-urile, β-sheet, and β-bend sunt tipurile de structuri cele mai frecvent întâlnite în proteine.
α-Helix-urile
Sunt structuri spiralate ce constă in măduva proteinei bine împachetată a proteinei cu radicalii specifici ai amino acizilor orientați înnspre exterior pentru a evita interferențrlr sterice. Aceste formațiuni sunt stabilizate de legăturile de hidrogen ce se formează între oxigenul grupării carbonil al unui amino acid și hidrogenul unei grupări amidice apartinând altui amino acid, grupări implicate în legătura peptidică.
α-Helix
Imagine preluată de pe www.uic.edu
β-sheet β-sheet este o altă formă de structură secundară în care toate legaturile peptidice sunt implicate în formarea punțiilor de hidrogen. Suprafețele acestor structuri apar a fi pliate așadar de multe ori i se mai spune si structură “foaie pliată”. Spre deosebire de α-Helix-uri, aceste structuri pot fi formare din două sau mai multe lanțuri peptidice ce pot fi privite ca niște săgeți orientate paralel sau anti-paralel.
B-sheet
Imagine preluată de pe www.chem.ucla.edu β-bend Aceste structuri întorc direcția lanțurilor peptidice ajutând în formarea unei forme globurare compacte. Formațiuniile β-bend se găsesc deobicei pe suprafețele moleculelor de proteine având de multe ori reziduri ionizate. Aceste formațiuni sunt formate de multe ori din 4 amino acizi printre care se numără prolina și glicina și sunt stabilizate prin legături de hidrogen.
B-bend. Imagine preluată de pe www.what-when-how.com
Structura tertială
Întregul aranjament tridimensional al tuturor atomilor dintr-o proteină reprezintă structura terțială. În timp ce structura secundară se referă la aranjamentul reziduurilor aminoacizilor care sunt vecini în structura primară, structura terțiară include aspecte ale aminoaciziilor pe o rază mai mare. Aminoacizi ce sunt îndepărtați în cadrul structurii primare si reziduă în structuri secundare diferite pot interacționa prin împachetarea proteinei. Locațiile îndoiturilor în lanțul polipeptidic, direcția și unghiul sunt determinate de numărul și locația aminoaciziilor ce favorizează aceste formațiuni: Pro, Thr, Ser și Gly.
Interacțiile ce au loc în structura terțiară
Imagine preluată de pe www.alevelnotes.com
Structura cuaternară
Multe proteine sunt constituite dintr-un singur lanț polipeptidic și se numesc proteine monomerice, însă există și proteine constituite din mai multe lanțuri polipeptidice ce pot fi identice sau diferite. Proteinele formate din două lanțuri (subunități) de numesc dimeri, din trei lanțuri timeri si așa mai departe. Aranjamentul acestor subunități reprezintă structura cuaternară. Subunitățile sunt legate între ele prin interacții necovalente cum ar fi: legături de hidrogen, legături ionice, interacții hidrofobe).
Strucutura cuaternară a proteinelor
Imagine preluată de pe www.swift.cmbi.ru.nl
I.1.1.2 Denaturarea proteinelor
Denaturarea proteinelor este rezultatul dezpachetării și dezorganizării structurilor terțiare si secundare, proces neacompaniat de hidroliza legăturilor peptidice. Printre agenții denaturanți se enumară: căldura, solvenții organici, agitarea mecanică, acizii și bazele puternice și ioni ai metalelor grele. În condiții ideale denaturarea poate fi reversibilă însă majoritatea odată denaturate rămân așa.
I.2 Informații generale despre superoxid dismutază
De când oxigenul molecular a apărut pe pământ diverse organisme și-au dezvoltat mecanisme pentru a face față la aceste molecule. În timp ce pentru aceste organisme, oxigenul molecular pare a fi esențial vieții, poate fi și periculos pentru menținerea viabilității celulei. Reducerea oxigenului la apă aduce energia necesară pentru diversele funcții din organismul nostru. Reducerea incompletă a acestuia in timpul respirației duce la formarea unor specii reactive de oxigen precum: anionul radical superoxid (O2.), radicalul hidroxil (.OH) și peroxidul de hidrogen (H2O2). Frecvent ele sunt formate prin reacții catalizate de către metale ca rezultat al metabolismului celular normal (respiratia si -oxidării al acizilor grași, precum si procesul inflamatoriu al căldurii, etanolului și stresului chimic.) Speciile reactive de oxigen cauzează daune oxidative asupra acizilor nucleici, lipidelor, proteinelor, carbohidraților si alte componente celulare. Ca raspuns la natura distructivă a speciilor reactive de oxigen, organismele cu creștere aerobă și-au dezvoltat multiple mecanisme de apărare si prevenție împotriva daunelor ce se pot produce la nivelul componentelor celulare. Mecanismul primar de apărare biologică împotriva stresului oxidativ include proteine ce înlătură speciile reactive de oxigen în timp ce sistemele defensive secundare consistă în enzime care înlătură si repară componentele celulare avariate în urma stresului oxidativ. Enzima anti-oxidantă Superoxid Dismutaza este implitcată în conversia anionului superoxid în oxigen molecular si peroxid de hidrogen care este degradat în continuare de catalaze sau peroxidaze. Saccharomyces cerevisiae, modelul preferat in cadrul studiului stresului oxidativ asupra celulelor eucariote, au în componență două izoforme, Cu/Zn superoxid dismutaza cu localizare citoplasmatica si Mn superoxid dismutaza cu localizare in matrixul mitocondrial ce au un rol important in protecția drojdiei împotriva toxicității oxigenului.2
Irwin Fridovich și Joe McCord3 au descoperit activitatea superoxid dismutazei. Înainte, superoxid dismutazele erau cunoscute drept un grup de metaloproteine cu funcție necunoscută, spre exemplu CuZnSOD era cunoscuta ca fiind o eritrocupreină și ca medicamentul veterinar antiinflamatoriu “Orgoteină”. De asemenea, Brewer a identificat o proteină ce funcționa ca o indofenol oxidază prin analiza de proteine cu gel de amidon folosind tehnica fenazin-tetrazoliu. Superoxid dismutaza se clasifică în funcție de cofactorul metalic prezent în situsul activ al enzimei. Pe baza acestei informații putem împarții superoxid dismutaza în 3 familii: Cu/ZnSOD (SOD1 care leaga simultam ambele metale), Mn/FeSOD (SOD2 care leagă numai unul dintre cele doua metale) si recent descoperitul NiSOD. Cupru/Zinc superoxis dismutaza
Se găsește4 în citosolul majorității eucarioatelor și la multe procariote, a fost izolată din fungi, drojdii, plante superioare iar Cu/ZnSOD comercială din inimile bovinelor. Cu o masă moleculară de aproximativ 32,5 kDa proteinele sunt dimeri formati din două subunități idendice de 16 kDa. Prin împachetarea proteinei se Cu/Zn SOD. Preluare de pe www.wikipedia.org formează o structura cilindrică ce conține 8 structuri -sheet antiparalele. Liganzii metalelor sunt reprezentati de 6 reziduuri de histidină plus unul care este împarțit de cele două metale si un aspartat. Cu din proteină se găsește sub formă de cation Cu2+ și este implicat în actul catalitic (Cu2+ + O2.- = Cu2+ + O2) în timp ce ionul de Zn2+ are rolul de a stabiliza molecula conferindu-i rezistență la diverși factori denaturanți. Două resturi de cisteină conservate ale fiecărui monomer sunt unite printr-o legătură disulfură iar această legătură este critică pentru activitatea enzimatică.Ccs1p livrează ionii de Cu la Sod1p și facilitează formarea legăturii bisulfidice intramoleculare. Cu toate că Cu/ZnSOD este citosolică, enzima si metalochaperonul ei Ccs1p se găsesc și în spatiul intermembranal mitocondrial (IMS) si are rolul de a metaboliza anionii radicali de superoxid proveniți din procesele mitocondriale.
Mutațiile nule în SOD1 sunt asociate cu o serie de defecte cum ar fi sensibilitatea la stres oxidativ, inclusiv incapacitatea de a crește în condiții aerobe pe mediu bogat, și hipersensibilitate la medicamente superoxid generatoare precum paraquatul. De asemenea null mutantii prezintă auxotrofie față de lizină și metionină. Acest defect poate fi considerat ca fiind datorită deteriorării oxidative a enzimelor implicate în biosinteza acestor aminoacizi.
Creșterea daunelor oxidative expuse de nul mutanții în SOD1 poate fi suprimată de mutații sau de supraexprimarea mai unor gene. Supraexprimarea genelor ATX1 sau ATX2 sau mutația a PMR1 sau BSD2 au fost gândite pentru suprimare prin modificarea homeostaziei ionilor metalici in timp ce in supraexprimarea TKL1 poate media supresia prin augumentarea producției de NADPH prin calea pentozofosfatului. Mutația genelor SSQ1, JAC1, NFS11 și ISU1 suprimă auxotrofia cauzată de SOD1, dar nu reversa sensibilitatea tulpinilor SOD1 la paraquat.
Activarea a SOD1p in vitro necesită atât o legatură prin cupru cu Ccs1p cât și expunerea la O2. În urma tranziției culturilor anaerobe la condiții aerobe rezultă apariția rapidă a activității SOD1p..
SOD2 (Mn-SOD sau Fe-SOD)
Mangan/Fier superoxid dismutaza folosită majoritar de procariote si protiste se găsește și în matrixul mitocondrial.
Mangan superoxid dismutaza se găsește în celulele eucariote cât și în cele procariote fiind localizată in mitocondriile celulelor eucariote cât și în țesuturile consumatoare de oxigen cum sunt ficatul și inima dar și la bacterii, alge eucariote si drojdii. MnSOD preluare de pe www.wikipedia.org
Fier superoxid dismutaza este găsită in celulele anaerobe și în celulele aerobe diazotrofe, în cioanobacterii și îm plastidele plantelor. Structura 3D a omologilor Mangan si Fier superoxid dismutaza au același aranjament al alfa-helixurilor iar situsurile lor active conțin acelaeși tipuri si aranjamente de aminoacizi, având formă homodimerică sau homotetramerică
Liniile cu gena SOD2 complet deletată prezintă hipersensibilitate la concentrații mari de oxigen si etanol dar cresc normal în prezența oxigenului atmosferic și mor rapid în stare staționară. Mutanții cu sod2 sunt asociați cu defecte precum: sensibilitate față de stresul oxidativ, sporulare defectivă, rezistenta la toxine scazuta, etc. SOD1 și SOD2 sunt printre primele gene implicate în îmbătrânirea cronologică a drojdiei. Deletarea genelor SOD1 și SOD2 din organism duce la micșorarea drastică a duratei vieții drojdiilor în timp ce amplificarea acestora extinde durata vietii insa nu afecteaza metabolismul.
Sod2p este un heterotetramer cu cate un atom de mangan per subunitate. Mangan chaperonul Mtm1p specific activează apo-Sod2p livrând ionul de mangan proteinei. Smf2p , o altă proteină transportoare de ioni metalici, regleaza disponibilitatea ionilor de mangan pentru Sod2p. Exprimarea SOD2 este reprimată în lipsa hemului și datorita nivelului scăzut de cAMP . Exprimarea SOD2 este reglată pozitiv activatorul complex hem-dependent Hap 2-3-4-5 si activatorul transcriptional liant de hem Hap1p. Transcriptia SOD2 implica proteine ce depisteaza oxigenul sau produși secundari ai respiratiei având în vedere ca paraquatul, un generator de radicali superoxid, și oxigenul pot induce transcripția SOD2.
Inactivarea SOD-ului mitocondrial la șoareci duce la cardiomiopatie, acumulări de lipide hepatice si moarte neonatală devreme și alte anormalități biochimice care au caracteristici similare cu miopatia mitocondrială.
Ni-SOD
Descoperită în anul 2008 se găsește la procariote si prezintă o structura hexamerică. Ce este deosebit la Ni-SOD este faptul ca de situsul activ se leagă nichelul în stare de oxidare III, o formă rar întalnită a metalului. Geometria situsului activ al nichelului variază de la plan-pătrată pentru Ni(II), având ca liganzi două funcţiuni tiol (Cys2 şi Cys6), un azot din structura His1 şi unul al Cys2, la cea piramidă plan-pătrată pentru Ni(III), la care se adaugă ca ligand, în poziție axiala, His1 Superoxid dismutazele se mai clasifică și în funcție de localizarea acestora în:
SOD1 ce conține ionii de Cu și Zn cu localizare în citosol; SOD2 ce conține ioni de Mn sau Fe cu localizare în matrixul mitocondrial și SOD3 ce conține tot ioni de Cu și Zn ce au localizare extracelulară și au rolul de controla concentrațiile de anioni radicali de superoxid din organism.
Imagine preluată de pe www.wikipedia.org
I.2.1 Importanță medicală
Stresul oxidativ se defineşte ca dezechilibrul dintre oxidanţi şi antioxidanţi în favoarea oxidanţilor, având potenţial distructiv şi patogenetic. Peroxizii şi radicalii liberi ce se formează în acest proces atacă toate componentele celulare, proteinele, lipidele şi
ADN-ul.
Din punct de vedere chimic, stresul oxidativ este asociat cu creşterea cantităţii de specii oxidante sau cu scăderea considerabilă a capacităţii mecanismelor de apărare antioxidante, precum cel mediat de glutation. Efectele stresului oxidativ depind de amploarea acestor modificări, celula fiind capabilă să depăşească mici perturbări şi să revină la starea ei iniţială. Totuşi, un stres oxidativ mai sever poate cauza necroza sau poate conduce la moartea celulei, iar un nivel moderat de oxidare poate declanşa apoptoza.5
Distructivitatea 6 stresului oxidativ constă in producerea de specii reactive de oxigen, iar cele mai puțin reactive, cum ar fi anionul superoxid, pot fi transformate în urma unor reacții redox în specii mai reactive extrem de nocive pentru organism.
Principiul terapeutic de prevenție a rănilor cauzate de radicalii liberi a fost periclizată de-a lungul timpului de către diverse speculații nefondate și încercări clinice dezamăgitoare. Însă enzimologiștii încă mai lucrează la medicamente viabile pe baza următoarelor prezumții făcute și sugerate pentru acceptarea generală: * Dacă superoxid dismutaza manifestă proprietăți terpeutice o face numai datorită funcției sale catalitice * Fiind o proteină de 32500 Da are foarte puține spre nici o șansă de supraviețuire în contact cu tractul digestiv atunci când este luată pe cale orală * Nu va intra în nici o celulă cu excepția celor specializate în absorbția proteinelor, exemplu: celulele tubulare renale sau fagocitele. Asta implică faptul că enzimele injectate pot interacționa numai cu radicalii superoxid din spațiul extracelular. Aceste interacții pot avea caracter terapeutic numai dacă produșii reacției enzimatice de dismutare sunt mai puțin toxici decât anionul radical superoxid.
I.2.1.1 Superoxid dismutaza în tratamentul cancerului.
Mecanismele7 responsabile pentru efectele radioprotectoare ale superoxid dismutazei sunt încă necunoscute dar aparent SOD poate inhiba efectele dăunătoare ale superoxidului asupra catenelor de ADN. Radiosensibilitatea mărită se datorează în special în prezența unui deficit de enzime antioxidante din organism. Ce este mai interesant este faptul că în urma iradierii cu proton a limfocitelor umane se înregistrează o reducere remarcabilă a MnSOD în adiție observându-se ca iradierea cu protoni este mai eficientă in creearea aberațiilor la nivelul ADNului decât razele X. Investigatorii au concluzionat așadar că activitatea redusă a MnSOD poate fi un contribuitor important a eficienței biologice ridicate a protonilor.
Deoarece speciile reactive de oxigen produse în timpul iradierii au o durată de viata foarte mică, s-a presupus că SOD trebuie să fie prezentă acolo în momentul generării radicalilor. Studii precedente au prezentat un maximum de supraviețuire în randul cobailor cât și protecția celulelor măduvei osoase când SOD a fost administrat cu 30-60 de minute înainte de iradiere. Alte experimente pe cobai au demonstrat că tratarea rozătoarelor cu SOD înainte și după iradiere a scăzut mortalitatea, afecțiuniile asupra pielii (căderea părului, cicatrizarea, eritemul), intensitatea simptomelor asociate cu pneumonie și fibroză pulmonară. O scădere a frecvenței apariției leucemiei la cobaii tratați cu SOD a fost înregistrată asociată cu administrarea intravenoasă cu SOD înainte si după iradiere. La nivelul plămâniilor, pneumonia apare devreme (în câteva zile sau săptămâni) iar fibrozarea apare târziu. Hemitoracele drept al cobailor a fost iradiat cu raze gama de 30Gy si 60Co, cobailor li s-a administrat Cu/ZnSOD intraperitonial la o oră înainte si o oră după iradiere și o data la 3 zile timp de 4 săptămâni dupa iradiere. Pneumonia la 4 săptămâni după iradiere a fost redusă iar inflamarea ganflionilor limfatici complet suprimată.
În prezent, în cadrul testărilor clinice se folosește în principal Cu/Zn superoxid dismutază extrasă din ficat de bovine, celulele altor mamifere sau eritrocite umane (exemplu Orgoteina) si a fost folosit cu succes în ameliolarea efectelor secundare are radioterapiei. Un studiu făcut asupra unor pacienți cu cancer de prostată si de vezică urinară cărora li s-a administrat Orgoteină la 15-30 de minute după ce au făcut radioterapie și s-a constatat o reducere majora a protictei, durerilor urinale și a dificultățiilor de a urina. Studii similare s-au efectuat pe carcinoame cervicale și tratate cu doze de 60 Gy, superoxid dismutaza a alinat cistitele, edemele, fibrozările, ulcerațiile, hemoragiile si disfuncțiile vezicii urinare când a fost aplicată dupa iradiere prin cateter la zona expusă radiațiilor. Procesele inflamatorii asociate cu radioterapia sunt inițiate de daune asupra țesuturilor ce atrage fagocitele care izbugnesc oxidativ creând inflamația. Superoxid dismutaza poate opri acest proces înainte de a fi amplificat. Utilitatea superoxid dismutazei ca agent anti-inflamator se crede a fi datorată eliberării scăzute de prostaglandină, tromboxani și a leucotrienelor rezultat ce rezultă în urma peroxidării lipidice.
I.2.1.2Superoxid dismutaza în artrita reumatoidă
Artrita reumatoidă (RA) este o boală autoimunitară inflamatorie în care sistemul imunitar care în mod normal apără corpul de infecții si a boli, atacă propriul organism. În cazul acestei boli sistemul imunitar atacă țesuturile care compun articulațiile provocând dureri, umflături și rigidizarea încheieturilor afectând abilitatea de a funcționa corespunzător. În timp, artrita reumatoidă poate avaria oasele si cartilajele din zona încheieturilor avariate.
Evidențe considerabile indică faptul că inflamarea articulațiilor paciențiilor cu artrită reumatoidă se datorează anionilor radicali superoxid generați de leucocitele impliicate în procesul de fagocitoză. Acest radical poate fi implicat în schimbările patoligice ale artritei reumatoide care se întâmplă în fluidul sinovial, cartilajul articular și țesutul sinovial.
Rolul superoxid dismutazei în ameliolarea simptomelor sau prevenția acestei boli este menționat anterior fiind cel de a inhiba agenții inflamatorii si de a reduce nivelul de radicali de superoxid o parte din aceștia fiind util în înlăturarea resturilor de bacterii fagocitate din spatiul intracelular.
Alte boli induse de surplusul de specii reactive de oxigen.
Prin acțiunea speciilor reactive de oxigen asupra aparatului genetic al celulor, afectând în special ADN-ul și mitocondriile acestea joaca un rol important în inducerea unor boli precum scleroza difuză, alergiile, boli degenerative precum Parkinson si Alzherimer, boli ale sistemului cardio-vascular, apariția cataractei, varicelor etc.
I.2.2 SOD mimetici
În particular, Cu,Zn-SOD8 a fost propusă spre uzul clinic, dar această enzimă are unele limitări farmacologice, precum costul ridicat, solubilitate lipidică mică, penetrare scăzută în celule, imunogenicitate, labilitate faţă de acţiunea proteazelor gastrice şi ale celor intestinale. Pentru a depăşi aceste probleme, complecşi metalici cu masă moleculară mică pot fi utilizaţi ca SOD mimetici, cu potenţial de agenţi farmacologici. Diverse combinații complexe ale metalelor cupru(II), fier(II), mangan(II) sau mangan(III) au fost caracterizate ca SOD mimetici. Majoritatea mimeticilor de SOD folosiți în prepararea medicamentelor sunt cei pe bază de mangan. Manganul este favorizat deoarece prin descompunerea catalizatorilui eliberează ioni liberi ai metalului in vivo iar ionul de mangan este cel mai puțin toxic mamiferelor.
Mecanismul de dismutare a O2.- de către SOD mimeticii cu mangan este la fel ca cel al enzimelor naturale și implică reducerea Mn(III) la Mn(II) de către O2.- care este oxidat la oxigen molecular. Iar Mn(II) este oxidat la Mn(III) prin reducerea altei molecule de O2.- rezultând o moleculă de H2O2.
MnIII + O2.- MnII + O2
MnII + 2H+ O2.- MnIII + H2O2
În continuare peroxidul de hidrogen rezultat este descompus în apă si oxigen molecular de către complexul SOD mimetic.
MnIII + H2O2 MnVO + H2O
MnVO + H2O2 MnIII + H2O + O2 I.3 SOD în Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces9 cerevisiae este o specie de drojdii foarte folosită încă din antichitate în brutărie și în fabricarea berii. Se presupune că a fost izolată inițial din coaja boabelor de struguri. Este unul dintre cele mai intens studiate organisme eucariotice, fiind un organism model în biologia celulară şi moleculară la fel cum Escherichia coli ocupă poziţia bacteriei model. Celulele de Saccharomyces cerevisiae sunt ovale cu diamentrul cuprins între 5 și 10 micrometrii. S. cerevisiae este considerată un model celular al eucariotelor deoarece îndeplinește mai multe criterii: * Este un organism unicelular de dimensiuni mici şi prezintă un timp de generare scurt (timpul de dublare este cuprins între 1,25–2 ore la o temperatură de 30 °C). * Se pot aduce modificări asupra genomului putând indroduce sau deleta gene si prezintă avantajul creșterii sub formă haploidă * În calitate de eucariotă, S. cerevisiae împarte structura internă complexă a celulelor plantelor și a animalelor fără a avea procentajul mare de ADN non-codificator pe care îl au eucariotele superioare.
Diferența majoră dintre celulele animale si drojdii reprezintă prezența peretelui celular rigid cere favorizează dezvoltarea cicatricilor de naștere în dimpul diviziunii. O altă deosebire este faptul că valuola înlocuiește lizozomii din celulele superioare.
În mod natural, celulele de S. cerevisiae trăiesc în medii bogate în oxigen având nevoie de antioxidanți exogeni pentru o bună dezvoltare. De aceea, celulele de drojdie de bere reprezintă un bun model pentru studiul in vivo a diferitelor sisteme antioxidante şi o alternativă atrăgătoare faţă de culturile de celule provenite din organisme superioare, precum cele de la mamifere.
Apariția stresului oxidativ la organismele aerobe este inevitabilă datorită metabolizării oxigenului. Stresul oxidativ este o stare a celulei în care nivelul speciilor reactive de oxigen depășește capacitatea de apărare de oxidanți a celulei.
Celulele aerobe şi-au dezvoltat mecanisme de apărare împotriva efectelor de distrugere cauzate de stresul oxidativ, denumite generic mecansime de răspuns la stresul oxidativ. În ciuda rolului pe care îl au mecanismele de răspuns la stresul oxidativ în menţinerea homeostaziei celulare (proprietatea unui organism de a menţine, în limite foarte apropiate, constantele mediului său intern), se ştie foarte puţin despre modul în care aceste mecanisme acţionează sau despre felul în care sunt reglate. Celulele de S. cerevisiae răspund la stresul oxidativ prin activarea multor gene implicate în protecţia acestui organism unicelular faţă de acţiunea dăunătoare a oxidanţilor. Printre acestea se numără şi genele care codifică cele două superoxiddismutaze, SOD1 şi SOD2. Superoxide dismutaza este o enzimă antioxidantă prezentă în toate organismele aerobe, catalizând dismutarea sau disproporiţonarea superoxidului la O2 şi H2O2.10
SOD1 şi SOD2 sunt printre primele gene care s-a dovedit a fi implicate în procesul de îmbătrânire a celulelor de drojdie. Deleţia atât a genei SOD1, cât şi a genei SOD2 reduce dramatic durata de viaţă şi viteza de replicare ale drojdiei de bere. Hiperexprimarea ambelor gene (SOD1 şi SOD2) extinde durata de supravieţuire, dar nu afectează ratele metabolice.
I.4 Menadiona
Menadiona11 este un compus chimic sintetizat în laborator ce prezintă activitate de vitamină K. Aceasta este un analog al 1,4 naftochinonei cu o grupare metil în poziția 2. În ciuda faptului că este un precursor al vitaminei K, menadiona nu este folosită cu scop farmaceutic de către țările dezvoltate economic. Folosirea a doze mari de menadionă prezentat reacții adverse preum: anemia hemolitica, daune la nivelul ficatului etc.
Aceste reacții adverse date de menadionă sunt datorate proprietății ei de genetator de anioni radicali superoxid. La intrarea în organism menadiona este redusă de către enzimele NAD(P)+ dependente la semichinonă respectiv hidrochinonă. În sens invers, oxigenul molecular din organism oxidează hidrochinona si semichinona reformând menadiona cu radicali superoxid ca produși secundari de reacție.
I.5 Scopul lucrării
Scopurile acestei lucrări a fost cel de a determina efectul menadionei în calitate de generator de anioni radicali superoxid asupra creșterii mai multor linii celulare de S. cerevisiae și cel de a determina acțiunea unui compus coordinativ de Mn(III) asupra activității SOD celulare.
Capitolul 2. Partea experimentală
II.1. Considerații generale.
II.1.1 Aparatură și ustensile * Pahar Berzelius * Pahare erlenmayer * Cilindru de 500 mL * Agitator magnetic * Spatulă * Replicator și Ștampilator * Plăci Petri
II.1.2. Linii celulare folosite.
În cadrul acestui studiu s-au folosit 34 de linii izogene cu linia parentală “wild type” (WT). Fiecare dintre aceste linii este genetic identică cu WT mai puțin gena specificată care este complet deletată din genomul respecitv. WT | sod1 | sod2 | yap1 | snk7 | ahp1 | gpx1 | gpx2 | ccs1 | hyr1 | tsa1 | msn2 | cot1 | smf1 | smf2 | pho84 | pmc1 | vcx1 | mid1 | cch1 | cnb1 | crz1 | yap2 | ire1 | hac1 | vip1 | kcs1 | yvc1 | cod1 | pmr1 | | cpp1 | prx1 | ctt1 | tsa2 | cta1 |
Linii celulare utilizate
II.1.3 Medii de cultură
Liniile celulare sod1și sod2pot crește pe medii de cultură complete YPD si sintetice SD. Mediul de cultură YPD conține 1% extract de drojdie, 2% peptona (sursă de aminoacizi) 2% glucoză (sursă de carbon). Mediul sintetic conţine 0,17 g sursă de azot fără aminoacizi şi sulfat de amoniu, 0,5 g sulfat de amoniu, 2 g glucoză şi 5 mL amestec de aminoacizi esenţiali. Lucrând pe medii solide am adăugat si 2% agar. Soluţiile au fost făcute în apă distilată (100 de mL) şi autoclavate timp de 20 de minute, la o temperatură de 121° C. În cadrul acestui studiu am folosit mediu sintetic SD fără lizină și metionină care se prepară la fel ca mediul complet numai că la prepararea amestecului de aminoacizi esențiali nu adăugăm aminoacizii menționați. Screening-ul genomic Pe plăcuțe cu mediu YPD suplimentat menadionă de concentrații de 0, 50, 100, 150 și 200 micromolar în mediu s-au ștampilat liniile menționate anterior provenite din culturi proaspăt preparate după care au fost lăsate la incubat 2 zile la temperatura de 28oC.
Screening în diluții seriale Pe plăcuțe cu mediile de cultură YPD și SD-K, M suplimentate cu menadionă astfel încât sa atingă concentrații de 0, 50, 100, 150 și 200 micromolar în mediu s-au ștampilat celule din liniile WT, sod1, sod2 și ccs1 in diluții seriale din 10 în 10, SD-K, M turnându-se în dublu exemplar. Dupa ce spoturile se usuca se lasa 2 zile la incubat la 28oC iar iar al doilea set de plăci petri cu mediu sintetic se lasă la lumina naturală la temperatura camerei.
II.2 Electroforeza
Electroforeza reprezintă o metodă de purificare a proteinelor ce se bazează pe migrarea lor sub formă ionizată sub influența unui câmp electric. Această metodă însă nu este folosită pentru a purifica proteine în cantități mari deoarece există variante mai simple si au tendința de a afecta structura si funcțiile lor biologice fiind folosită mai degrabă în scopuri analitice. Avantajul acestei metode îl reprezintă faptul că proteinele pot fi serparate și vizualizate oferindu-i cercetătorului oportunitatea de a afla ce proteine se află intr-un amestec și gradul acestora de puritate. De asemenea prin electroforeză se pot determina proprietăți importante ale proteinelor precum punctu l izoelectric și masa moleculară aproximativă. Proteinele si polipeptidele sunt compuşi amfoterici, a căror încărcare electrică depinde de pH. Astfel, în soluţii cu pH peste pH-ul izoelectric sarcina netă va fi negativă, iar la pH sub pH-ul izoelectric sarcina netă va fi pozitivă. În general electroforezele de proteine se realizează în gel de poliacrilamidă. Gelul se comportă ca o sită, încetinind migrarea acestora. Migrarea poate fi afectată și de forma proteinelor. În electroforeză, forța ce mișcă macromoleculele este potențialul electric, E. Mobilitatea electroforetică, , este rația dinre velocitatea particulelor, V, și potențialul electroforetic. Mobilitatea electroforetică este egală de asemenea și cu sarcina netă a moleculei, Z, împărțită la coeficientul de fricțiune, f, ce reflectă parțial forma proteinei.12
II.2.1 Prepararea soluțiilor de acrilamidă Gelurile de poliacrilamidă se obţin prin polimerizarea a două componente: acrilamida şi metilen-bis-acrilamida. Prima componentă polimerizează cu formarea unui lanţ, iar cea de-a doua prezintă două capete reactive, ce permit formarea unor conexiuni între lanţurile liniare formate de acrilamidă. Raportul dintre metilen-bis-acrilamidă şi acrilamidă dictează mărimea porilor. În cazul în care porii sunt mici/mari se pot separa proteine cu mase moleculare mai mari/mici. Cel mai frecvent se folosesc geluri în care concentraţiile celor două componente sunt 16% (acrilamidă) şi 0,4% (metilen-bis-acrilamidă). Polimerizarea acrilamidelor se desfăşoară după un mecanism radicalic (ecuaţiile (1) – (4)). Această reacţie este iniţiată de persulfatul de amoniu, (NH4)2S2O8 (APS). Drept catalizator se foloseşte N,N,N’,N’-tetrametilendiamina (TEMED). 1) Etapa de iniţiere: | (1) |
2) Etape de propagare: | (2) | 3) Etapa de elongare: | (3) | | (4) | Oxigenul din soluţie inhibă polimerizarea şi din această cauză amestecul supus polimerizării este degazat. Înaintea polimerizării, amestecul este aşezat între două plăci de sticlă. Gelul astfel polimerizat este ataşat la un sistem de separare vertical. Acest sistem permite contactul cu ambele capete ale gelului prin intermediul unor camere destinate soluţiilor tampon (în care se află electrozii). Probele de analizat sau proteinele standard sunt adăugate în partea superioară (catod, încarcat negativ) a gelului cu ajutorul unei pipete automate. Din cauza faptului că amestecul de proteine este situat la câţiva mm deasupra gelului (într-un locaş separat), dar şi din cauza diferenţelor dintre cantităţile (volumele) de probă încărcate, punctul de start poate varia. Acest inconvenient poate fi depăşit prin folosirea unui gel de aşezare care este polimerizat deasupra gelului de separare. Gelul de aşezare (cu lăţimea de cca un centimetru) are porii mai mari şi permite concentrarea probei. Amestecul de proteine din proba concentrată migrează în gelul de separare, în funcţie de masa moleculară. Proteinele cu mase moleculare mai mici se vor deplasa mai repede spre anod (+), iar proteinele mai mari vor parcurge mai lent gelul polimerizat. II.2.2.Prepararea soluțiilor tampon Tamponul pentru electroforeză a fost preparat prin dizolvarea a 4,16 g K2HPO4, 2,48 g KH2PO4, 3,81 mg riboflavină și 46,62 mg nitroblue tetrazoliu în 500 ml apă distilată.
II.2.3. Prepararea și aplicarea gelurilor Se prepară gelul de migrare cu o concentraţie de acrilamidă ce va ţine cont de greutatea moleculară (kDa) a proteinelor ce vor suferi procesul de migrare, utilizând datele din tabelul urmator: Tabelul 1. Valorile concentraţiei de poliacrilamidă în funcţie de dimensiunea proteinelor ce trebuie separate Acrilamidă(%) | Dimensiunea proteinelor de separat(kDa) | 5 | 25 - 200 | 10 | 15 - 70 | 15 | 12 - 45 | După stabilirea concentraţiei de acrilamidă, se pipetează peste volumul de gel cu o anumită concentraţie de acrilamidă aleasă în funcţie de greutatea moleculară a proteinelor, soluţia tampon, APS şi TEMED, conform indicaţiilor din tabelul următor.
Tabelul 2 Compoziţia gelului de migrare Substanţa / concentraţia de acrilamidă a gelului | Gel de migrare | | 7,5% | 10% | 12% | 15% | Volum de gel ce trebuie preparat (mL) | 5 | 10 | 5 | 10 | 5 | 10 | 5 | 10 | apă distilată (mL) | 2,5 | 5 | 2 | 4 | 1,75 | 3,5 | 1,25 | 1,25 | 0,5M Tris-HCl (pH 6,8) - 0,4% SDS (mL) | - | - | - | - | - | - | - | - | 1,5M BazaTris (pH 6,8) - 0,4% SDS (mL) | 1,25 | 2,5 | 1,25 | 2,5 | 1,25 | 2,5 | 1,25 | 2,5 | 30% acrilamidă -0,8% Bis (mL) | 1,25 | 2,5 | 1,65 | 3,3 | 2 | 4 | 2,5 | 5 | Soluţie APS 10% (µL) | 30 | 50 | 30 | 50 | 30 | 50 | 30 | 50 | Soluţie TEMED (µL) | 3 | 5 | 3 | 5 | 3 | 5 | 3 | 5 | Persulfatul de amoniu se adaugă întotdeauna la sfârşit. Dacă soluția de APS nu este proaspătă, se adaugă o cantitate dublă. Un gel de 0,5 mm necesită, în general, 3 ml de soluţie, unul de 0,75 mm necesită 5 ml de soluţie, unul de 1 mm necesită 6 ml de soluţie, iar unul de 1,5 mm necesită 8,5 ml soluţie. Gelurile de 0,5 (dar şi cele de 0,75 mm uneori) sunt dificil de manipulat şi se rup uşor.
Utilizând o pipetă Pasteur sau o pipetă automată se toarnă gelul de migrare în casetă, printr-o margine a acesteia, până când soluţia ajunge la cca 2 cm de marginea superioară a casetei. Pentru a se asigura că gelul va avea o suprafaţă netedă, se va pipeta deasupra, cu grijă, 0,5 mL izobutanol (sau eventual izopropanol). Verificarea gelului se face prin observarea polimerizării soluţiei rămase în recipientul în care aceasta s-a preparat.
După ce gelul de migrare este polimerizat se prepară gelul de concentrare (2 mL, 4% acrilamidă pentru un gel), conform tabelului următor: Tabelul 3 . Compoziţia gelului de concentrare Volum / soluții | Gel de concentrare 4% | Volumul gelului de concentrare | 5 mL | apă distilată (mL) | 3,1 | Tris-HCl 0,5M, pH 6,8 - SDS 0,4% (mL) | 1,25 | Tris-HCl 1,5M, pH 6,8 - SDS 0,4% (mL) | - | acrilamidă 30% - Bis 0,8% (mL) | 0,65 | soluție de APS 10% (µL) | 30 | TEMED (µL) | 5 | Odată gelul de migrare întărit, se varsă alcoolul de la suprafaţă, se spală de 3 ori cu apă distilată (3 x 0,5 mL) şi se pipetează gelul de concentrare până când nivelul soluţiei ajunge la 0,5 cm de marginea superioară a casetei. Se introduce până la jumătatea gelului de concentrare un pieptene special pentru formarea godeurilor şi se lasă cca. 20 minute (se verifică polimerizarea soluţiei care a rămas în flaconul în care s-a preparat). Pieptenele se scoate apoi cu grijă, iar godeurile rămase se spală cu tampon de electroforeză, pentru îndepărtarea eventualei soluţii de acrilamidă nepolimerizată. II.2.4 Pregătirea cuvei de electroforeză şi aplicarea probelor
Se asamblează caseta în cuva de electroforeză şi se umple rezervorul cu tampon de electroforeză în aşa fel încât să facă posibilă trecerea curentului electric între catod şi anod (forma şi capacitatea dispozitivelor de electroforeză variază de la o firmă la alta) Se asigură că electrozii sunt aranjaţi astfel încât proteinele să migreze spre anod.
Godeurile care sunt deja pline cu tampon pot fi încărcate cu probe cu ajutorul unei pipete automate. Inaintea aplicarii, peste probele de analizat se introduce o solutie de tampon de incarcare, care datorita densităţii mari a soluţiei va conduce probele in partea de jos a godeului.
Reactivii folositi in electroforeza in gel de poliacrilamida:
- 2-mercaptoetanol;
- soluţie de acrilamidă 30% (ATENŢIE! monomerul de acrilamidă este neurotoxic, cu efecte cumulative);
- N,N,N',N'-tetrametiletilendiamină (TEMED);
- izobutanol (izopropanol);
- soluţie tampon de colorare/fixare proteine ;
- soluţie tampon de decolorare;
- soluţie tampon de incarcare a probelor;
- soluţie tampon pentru prepararea gelului de separare: Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8.;
- soluţie tampon pentru prepararea gelului de concentrare: Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8; soluții tampon de migrare de lucru (tampon de migrare 1x).
II.2.5.Prepararea soluțiilor de colorare a gelurilor
Există două metode frecvent utilizate la colorarea gelurilor rezultate după SDS electroforeză. Colorantul cel mai des utilizat pentru vizualizarea proteinelor este Coomassie
Brilliant Blue (R-250). Gelul este incubat într-o soluţie acidă (acid acetic/metanol) în care este dizolvat colorantul. Proteinele sunt astfel fixate şi devin încărcate pozitiv, fapt care determină o interacţie puternică cu colorantul. După spălarea cu o soluţie de decolorare (pentru îndepărtarea colorantului legat nespecific) cantităţi mici de proteine (0,1 - 1μg) pot fi vizualizate (Smith, 1984) sub forma unor benzi de culoare albastră.
II.3 Rezultate
II.3.1 Screening-ul genomic
Screenining-ul efectuat Screenining-ul efectuat la concentrație 0 M la concentrație 100 M
Precum putem observa la concentrații mici de menadiona prima linie care își manifestă sensibilitatea față de menadionă este linia defectivă in sod1.
Mărind concentrația la 100 M observăm că creșterea liniilor ccs1 si kcs1 este inhibată. Linia defectivă în ccs1 este o linie importantă în studiul de față deoarece aceasta reprezintă metalochaperonul proteinei SOD1.
Screening efectuat la 150M menadionă
Mărind concentrația la 150 M liniile sod2 și yap1 devin sensibile. Yap1 este o genă ce codifică un factor de transcripție implicat în răspunsul celular în condiții de stres oxidativ.
Screening efectuat la 200M menadionă
Screening efectuat la 250M menadionă Screening efectuat la 300M menadionă
La concentrații mari de menadionă, în ciuda faptului că menadiona își manifestă toxicitatea până și asupra linei Wild Type, se observă niște linii tolerante. Acestea au fost indetificate ca fiind liniile cu urmatoarele gene deletate: * gpx1, gpx2, ccp1, prx1 – gene implicate în răspunsul față de stresul oxidativ, acestea codifică glutationperoxidaze care generează anioni radicali superoxid, absența lor mărește rezistența celulei la stresul oxidativ * hac1, vip1, yvc1 – codifică proteine implicate în inducerea apoptozei (moartea celulei)
II.3.2 Screening în diluții seriale
SD- K, M tinute la lumina concentratie 0 M MD SD – K M la 28oC 0M MD
SD- K, M tinute la lumina concentratie 50M MD SD – K M la 28oC 50 M MD
SD- K, M tinute la lumina concentratie 100 M MD SD – K M la 28oC 100 M MD
SD- K, M tinute la lumina concentratie 150M MD SD – K M la 28oC 150 M MD
SD- K, M tinute la lumina concentratie 150 M MD SD – K M la 28oC 150 M MD
II.3.3 Electroforeza
Concluzii În cadrul acestei lucrări s-a efectuat un screening genomic pe 35 de linii celulare nul-mutante pentru a se observa sensibilitatea acestora față de menadionă. Ca rezultat s-au identificat 3 linii hipersensibile (sod1, ccs1și yap1) , 17 linii moderat sensibile și 15 linii celulare rezistente (gpx1, gpx2, cot1, vcx1, cnb1, crz1, hac1, vip1, yvc1, pmr1 cpp1, prx1, ctt1, tsa1, cta1). S-a testat compusul mononuclear cu ioni de Mn(III) ca modulator al activității SOD și s-au investigat mecanismele moleculare responsabile pentru toxicitatea menadionei.
Bibliografie
1. Biochemistry 3ed – Lippincott Illustrated Reviews, Pamela C. Champe, Richard A.
Harvey , Denise R. Ferrier, 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Wolters Kluwer
Ed
2. M. D. Pereira, E. CA Eleutherio and A. D. Panek, BMC Microbiology, 2001, 1
3, 11. www.wikipedia.org
4. http://www.yeastgenome.org/
5. F.Q. Schafer, G.R. Buettner, Free Radic. Biol. Med, 2001, 30, 1191
6. M. Valko, H. Morris, M.T. Cronin, Curr. Med. Chem., 2005, 12, 1161
7. Daila S. Gridley, Lora M. Green, Gregory A. Nelson, Michael J. Pecaut, and James M. Slater, Madame Curie Bioscience Database, 2000
8. V Lanza, G Vecchio, Journal of Inorganic Biochemistry, 2008,
9. T. Boekhout, V. Robert, ed (2003). Yeasts in food p.322.
10. F.L. Muller, M.S. Lustgarten, Y. Jang, A. Richardson, H. Van Remmen, Free Radic Biol Med, 2007, 43, 477
12. Lehninger Principles of Biochemistry 4ed - David L. Nelson Michael M. Cox
