Instituto Superior Técnico – Universidade de Lisboa
Estudo da Actividade Cinética da Invertase Livre e Imobilizada
Laboratório de Engenharia Biológica I
Ana Miguel Henriques 73402 Célia Spínola 79407 Leonor Morais 72623 Luís Bento 67273
Estudo da Actividade Cinética da Invertase Livre e Imobilizada
DE P AR T AME N T O DE BI O E N GE N H AR IA , IN S TI T U T O S UPE RI O R TÉ CN I C O, U N IVE RS I DA D E DE L IS B O A, A V. R O VIS C O PAIS , LIS B O A
Resumo: A Invertase (EC 3.2.1.26) é uma enzima intracelular extensamente utilizada na hidrólise da sacarose numa mistura equimolar de glucose e frutose, açúcar invertido, principais adoçantes utilizados industrialmente. Realizou-se um estudo comparativo entre as características cinéticas da Invertase em condições nativas e da enzima imobilizada em Alginato de Cálcio, na presença de substrato, sacarose, a várias concentrações e em condições óptimas de pH (4.5) e temperatura (45°C). Recorreu-se ao método Lineweaver-Burk para determinação dos parâmetros Vmáx e constante de Michaelis, Km que foram 0,135 g-AR/Lmin e 11,7 g-AR/L, respetivamente para a enzima livre e 0,0979 g-AR/Lmin e 15,9 g-AR/L, para a enzima imobilizada. O factor de efectividade global para o sistema imobilizado foi (66,57 ± 1,75)%.
I NTRODUÇÃO
As enzimas são catalisadores, aumentam a velocidade ou possibilitam reacções químicas, diminuindo a energia de activação. Têm uma elevada especificidade e apenas actuam em condições favoráveis de temperatura, pH e concentração do substrato. A levedura Saccharomyces bayanus produz a enzima Invertase, capaz de hidrolisar sacarose em açúcar invertido1, mistura equimolar de glucose e frutose, que possui aplicação na indústria alimentar como adoçante em diversos produtos. Industrialmente, a produção de açúcares invertidos por processo enzimático é bastante eficiente apesar de mais dispendioso em relação ao processo de hidrólise ácida, catalisado por um ácido, pois este efectua-se em condições extremas de pH baixo e temperatura elevada conduzindo à formação de um composto colorido - hidroximetilfurfural.
1
O uso de enzimas livres na indústria é reduzido devido ao seu elevado custo, instabilidade e irrecuperabilidade. De forma a tornar este processo mais atraente do ponto de vista económico, este deve ser operado em condições que permitam reutilizar a enzima. As enzimas actuam tanto na sua forma nativa como imobilizadas numa fase sólida, como géis, permanecendo activas. O processo de imobilização não pode ser prejudicial à estrutura da enzima nem produzir nenhuma substância tóxica, neste caso, o gel de alginato2 apresenta-se com uma boa opção, sendo de baixo custo, não causando alterações bruscas de temperatura, pH ou pressão osmótica e possuindo porosidade ideal para reter microorganismos, permitindo, assim, a sua actividade e viabilidade por tempo indefinido e a difusão do substrato e produto. É, por isso, extensamente utilizado na indústria
2 Alginato
O termo invertido decorre da alteração da direcção de propagação de luz polarizada. Numa solução com sacarose a luz é desviada para a direita enquanto que uma solução de frutose e glicose desvia a luz para a esquerda.
é um polissacarídeo linear extraído da parede celular de algas castanhas, marinhas, e permite que a enzima fique mais estável termicamente devido à sua natureza hidrofílica.
1
Estudo da actividade cinética da Invertase livre e imobilizada alimentar e farmacêutica. Como desvantagens, este polímero destaca-se pela sua instabilidade na presença de fosfato, lactato e citrato e limitações à transferência de substrato e produto. Nesta actividade laboratorial confrontou-se a efectividade global entre a actividade cinética da enzima Invertase livre e a Imobilizada em Alginato de Cálcio3, de concentração 1%(p/V) e a um pH óptimo de 4,5 e 45°C, para concentrações de substrato de 10 a 100g/L. (30.1300±0.0001g) e divididas em 10 porções (3.0130±0.0001g cada)4.
E NSAIOS
Foram efectuados dois ensaios a 45°C para cada concentração de sacarose utilizada (10, 15, 25, 35, 45, 55, 70, 100 g/L), um com enzima livre e o outro com enzima imobilizada. As soluções de sacarose foram preparadas em tampão acetato 20mM pH 4.5, contendo 1% (p/v) de cloreto de cálcio5. No caso da enzima livre os ensaios foram efectuados usando 0.5ml de uma suspensão a 1% (p/v) da levedura em água destilada (0.1970±0.0001g/20ml de água). Retirou-se uma toma inicial de 0.5ml e outra novamente a cada minuto durante 9 minutos. Quanto ao estudo da enzima imobilizada, utilizou-se uma porção de esferas previamente pesada por ensaio. As tomas foram também de 0.5ml mas a cada 3 minutos até se completarem 15 minutos.
M ATERIAIS M ATERIAIS
E
M ÉTODOS
A solução enzimática preparada a partir da levedura Saccharomyces Bayanus, foi comprada na LALVIN. Para o processo de imobilização foi usado alginato de sódio. Os restantes compostos usados eram reagentes de qualidade analítica. Os espectofotómetros utilizados foram T70 UV/VIS - Spectrometer da PG Instruments Ltd.
D ETERMINAÇÃO
CINÉTICOS
DE PARÂM ETROS
I MOBILIZAÇÃO
CÁLCIO
EM ALGIN ATO DE
Preparou-se a suspensão a usar no reactor adicionando 5ml de uma suspensão de S. Bayanus 1% (p/v) a 34ml de uma solução de alginato de sódio 3.0% (p/v) a 45°C. As esferas de gel foram formadas fazendo a adição gota a gota da suspensão enzimática em CaCl2 2% (p/v). Após 5 minutos as esferas foram retiradas com uma rede, lavadas em tampão acetato 20mM pH 4.5, com 1% (p/v) de cloreto de cálcio para manterem a consistência, e parcialmente secadas, cuidadosamente, com papel absorvente. As esferas com enzima imobilizada foram pesadas
3
Cada toma dos ensaios foi adicionada a um tubo de ensaio contendo 0.5ml de DNS, de modo a parar a reacção de imediato6. Cada tubo (incluindo um branco de tampão acetato pH 4.5 para leitura de absorvância) foi tapado, aquecido a 100°C por 5 minutos e posteriormente arrefecido com água. Adicionou-se 5ml de água destilada e agitou-se num vórtex. Mediu-se
4 Cada porção é o equivalente em esferas ao volume
A enzima é incorporada numa solução de Alginato de Sódio e, em contacto com uma solução de iões Cálcio, gelifica por troca iónica.
de suspensão enzimática usada nos ensaios com enzima livre (0.5ml). 5 Como supramencionado era necessário utilizar cloreto de cálcio nos ensaios com a enzima imobilizada, logo usou-se também nos ensaios de enzima livre para a variável estar controlada. 6 Tal precaução destinava-se à enzima livre já que no caso da enzima imobilizada não era retirado enzima na toma, pelo que a reacção não continuava no volume recolhido.
2
Estudo da actividade cinética da Invertase livre e imobilizada então a absorvância de cada solução contra o branco a 540nm7. Os valores de absorvância medidos foram convertidos a concentração de açúcares redutores na solução através da recta de calibração da figura 1, específica a cada espetrofotómetro usado. Estas rectas foram obtidas medindo a absorvância de várias soluções-padrão de glucose, submetidas ao mesmo procedimento que as amostras, com concentrações até 0.1% (p/v).
D ETERMINAÇÃO
DO FACTO R DE
EFECTIVIDADE GLOBAL Este parâmetro foi calculado para cada concentração de sacarose usada recorrendo à equação (5). De seguida calculou-se a média desses resultados de modo a obter o valor final. (5)
R ESULTADOS P ARÂMETROS
E DISCUSSÃ O CINÉTICOS
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 -0,1 0,0
Abs (540nm)
0,5
1,0
[Glucose] (mg/mL)
FIG 1 RECTAS DE CALIBRAÇÃO DO REAGENTE PELO
MÉTODO DE DNS. PG70, AAPG80, ABS=0,512[GLU]-0,012 ABS=0,537[GLU]-0,003
Os parâmetros cinéticos da hidrólise da sacarose foram determinados usando a enzima invertase livre e imobilizada. A figura 2 representa a relação obtida para a velocidade inicial e a concentração de substrato consumida para a enzima livre e imobilizada, utilizando-se o modelo de Michaelis-Menten.
0,12
(1) Usando a linearização LineweaverBurk (2), o diagrama de Eadie-Hofstee (3) e de Hans-Woolf (4) para obter os parâmetros cinéticos Vmáx e constante de Michaelis, Km, a partir das velocidades iniciais para as várias concentrações de substrato. (2) (3) (4)
7
V0 (g-AR/L.min)
O modelo utilizado para o estudo cinético foi o de Michaelis-Menten,
0,1
0,08 0,06 0,04 0,02 0 0 50 100
[S0] (g-Sacarose/L)
FIG. 2 MODELO DE MICHAELIS-MENTEN PARA A ENZIMA LIVRE
E IMOBILIZADA, E DESVIOS-PADRÃO DE CADA PONTO. ENZIMA LIVRE ( ) ENZIMA IMOBILIZADA( )
De referir que o ponto correspondente à concentração de 25gSacarose/L, para a enzima livre foi removido por lhe estar associado um elevado desvio-padrão. Seria de esperar que a partir da concentração de substrato à qual as velocidades se tornam constantes, ou seja, todos os centros activos das enzimas estão ocupados, as velocidades fossem idênticas entre a enzima livre e imobilizada. No 3
Máximo de absorção do ácido 3-amino-5nitrosalicílico, formado quando o DNS reage com um açúcar redutor como a sacarose.[1]
Estudo da actividade cinética da Invertase livre e imobilizada entanto, tal não se verifica, sendo as velocidades de consumo de substrato da enzima imobilizada sempre inferiores às da enzima livre. Considera-se a possibilidade do gel de Alginato de Cálcio, apesar do tamanho ideal da malha, apresentar-se como barreira à entrada livre do substrato para dentro do microorganismo, ou seja, o transporte de substrato implicava o gasto de alguma energia, o que limitaria a sua passagem. Em suma, assume-se que a concentração de substrato no seio da solução é superior à concentração de substrato na superfície das esferas de alginato, devido à formação da camada de estagnação à volta destas. Uma forma de contrariar este fenómeno seria aumentar a concentração de substrato na solução de forma a atingir as concentrações de sacarose dentro das esferas iguais às da enzima livre e portanto comparar os parâmetros cinéticos para uma situação em que as células estivessem em contacto com a mesma concentração de substrato. Usando o método de LineweaverBurk (figura 3) calcularam-se os valores das constantes aparentes de Michaelis para a invertase livre e imobilizada em gel de alginato, que se encontram resumidos na tabela 1.
30
inicial e da concentração de substrato, aumentando, por isso, os erros associados, e a compressão verificada nos pontos referentes às concentrações de substrato mais elevadas, utilizou-se a operação Solver do Microsoft Excel que, por análise de hipóteses para minimizar o erro, atribui valores aos parâmetros cinéticos, apresentados na tabela 1.
TABELA 1 CONSTANTES CINÉTICAS DA ENZIMA LIVRE E
IMOBILIZADA, A PARTIR DOS DADOS DA LINEWEAVER-BURK E A PARTIR DA OPERAÇÃO SOLVER EM MICROSOFT EXCEL
Lineweaver-Burk
Livre
g-AR/L
KM
g-AR/Lmin
Vmáx
11.7
0.135 0.133 0.0979 0.0976
Solver
Imobilizada
10.9 15.9
Solver
15.7
1/V0 (Lmin/g-AR)
25 20 15 10 5 -0,05 0 -0,02 0,01 0,04 0,07 0,1
Relativamente às equações obtidas, a correlação de dados foi melhor no caso da enzima imobilizada, tal como a semelhança com o valor obtido pelo Solver. A razão deverá estar relacionada com o facto de a enzima estar imobilizada, conduzindo a uma levedura menos exposta e consequentemente bastante mais estável. No caso da enzima livre os parâmetros obtidos distanciam-se ligeiramente dos valores do Solver, ou seja, existem mais erros associados a estas medições relativamente ao modelo previsto de Michaelis-Menten. Verifica-se também que, quando a enzima está imobilizada em gel de alginato, o valor de KM da enzima imobilizada aumentou em relação à livre, enquanto o valor de Vmáx diminuiu. Relativamente ao aumento do KM, concentração à qual se atinge metade da velocidade máxima, é facilmente justificável, considerando que , correspondem, constantes de em que k-1 e k1 respectivamente, às velocidade da reacção 4
-0,08
1/[So] (L/g)
FIG. 3 LINEARIZAÇÃO DE LINEWEAVER-BURK PARA A ENZIMA
LIVRE E IMOBILIZADA. ( ) ENZIMA LIVRE , ( ) ENZIMA IMOBILIZADA
De modo a compensar as limitações do método de Lineweaver-Burk, ou seja, o facto de este usar o inverso da velocidade
Estudo da actividade cinética da Invertase livre e imobilizada inversa e directa da formação do complexo Enzima-Substrato, enquanto que k2 corresponde à constante de velocidade de dissociação do complexo em produto e enzima. Desta forma, um aumento no KM traduz um aumento na velocidade de formação do produto, e/ou uma diminuição na formação do complexo EnzimaSubstrato, ambas causas directas da imobilização da enzima. O substrato está menos acessível, reduzindo a afinidade. Relativamente à Vmáx, esta devia ser a mesma na enzima imobilizada e livre porque traduz a ocupação pelo substrato de todos os centros ativos da enzima. Contudo, tal não se verificou, observandose uma diminuição no caso da enzima imobilizada, o que já se tinha constatado anteriormente. Uma explicação plausível para justificar esta diminuição na Vmáx passa pelo facto de existir um baixo transporte de substrato e produtos para dentro e fora das esferas de gel, implicando que a Vmáx demora mais tempo a ser atingida. Seria necessário realizar ensaios para concentrações iniciais de substrato maiores de 100 g/L, para avaliar se seria este o motivo. Contudo o aumento de concentração nunca poderia ser muito elevado, pois a enzima livre já teria saturado a aproximadamente 50gSacarose/L. Para além disso, quando há demasiado substrato presente em relação ao número de enzimas, a relação enzimasubstrato deixa de ser ideal e portanto poderá verificar-se inibição da actividade da enzima, o que não é desejável. Outra possibilidade para a diminuição do Vmáx também pode passar pela dificuldade de ligação de substrato a todos os centros ativos devido ao facto de estes se encontrarem bloqueados ou, embora improvável, tenha ocorrido uma alteração na configuração da invertase ou que se tenham perdido células na experiência laboratorial. [3] No sentido de comparar os parâmetros cinéticos obtidos com Lineweaver-Burk, utilizaram-se outras linearizações do modelo Michaelis-Menten: diagrama de Eadie-Hofstee (figura 4) e de Hanes-Woolf (figura 5). As equações e parâmetros obtidos encontram-se resumidos na tabela 2.
0,15
Estudo da actividade cinética da Invertase livre e imobilizada
TABELA 2 RETAS OBTIDAS PELAS LINEARIZAÇÕES DE EADIEHOFSTEE E HANES-WOOLF, CINÉTICOS E RESPECTIVOS PARAMETROS
TABELA
3 (ERROS)2 EM RELAÇÃO AOS PARÂMETROS CINÉTICOS OBTIDOS PARA O MÉTODO DE LINEWEAVER-BURK, PARA A OPERAÇÃO SOLVER E PARA AS LINEARIZAÇÕES DE EADIEHOFSTEE E HANES-WOOLF.
(ERRO)2
Nestas linearizações, ao contrário de em Lineweaver-Burk, verifica-se que os pontos contribuem de forma mais equitativa para a equação da regressão, pois estão mais distanciados. No diagrama de Hanes-Woolf as correlações obtidas são bastante agradáveis, no entanto sem significado pois a ordenada depende da abcissa, neste caso concentração do substrato. O mesmo se aplica ao diagrama de Eadie-Hofstie, sendo que neste caso a abcissa depende da ordenada, velocidade inicial. Verifica-se ainda assim semelhança nos parâmetros cinéticos calculados com os de Lineweaver-Burk. Na tabela 3 encontram-se as médias dos valores de em relação aos parâmetros Vmáx e KM calculados para Lineweaver-Burk, para a operação solver aplicada ao método anterior e para cada linearização.
Como seria de esperar, os erros associados à operação Solver foram inferiores aos associados a LineweaverBurk e às duas linearizações, visto a função forçar os valores dos parâmetros que melhor se adequam aos dados. Verificou-se que no caso da enzima imobilizada, os erros foram sempre inferiores aos da enzima livre, devido à sua maior estabilidade no gel. A linearização de Eadie-Hofstee representa a cinética enzimática com o menor erro em relação ao modelo para a enzima livre, no entanto não há diferença do erro associado à enzima imobilizada em relação ao calculado para a LineweaverBurk. A relação de Hanes-Woolf tem erros associados significativamente maiores tanto para o sistema livre como imobilizado, sendo, por isso, a pior linearização.
F ATOR
DE EFETIVIDADE GLOBAL
PARA O SISTEMA IMOBILIZADO O fator de efetividade global para o sistema imobilizado (η) é de (66,57 ± 0,92)% [variação da efetividade global para os sistema imobilizado com a concentração inicial de sacarose na figura 6]. Este valor devia aproximar-se de 100% com o aumento da concentração de sacarose pois a partir da concentração de substrato à qual as velocidades se tornam constantes 6
Estudo da actividade cinética da Invertase livre e imobilizada as velocidades da enzima imobilizada e livre deveriam ser idênticas. Como visto anteriormente, tal não acontece, sendo as velocidades da enzima imobilizada inferiores às da enzima livre.
0,80 0,75 0,70
R EFERÊNCIAS
[1] Nigam, Arti, e Ayyagari, Archana. Lab Manual in Biochemistry, Immunology and Biotechnology, New Delhi: Tata McGrawHill Pub., 2007. Print. [2] Vu, T. K. H. and Le, V. V. M. Biochemical Studies on the Immobilization of the Enzyme Invertase (EC.3.2.1.26) in Alginate Gel and its Kinetics. Department of Food Technology, Ho Chi Minh City University of Technology, 268 Ly Thuong Kiet, District 10, Ho Chi Minh City, Vietnam. ASEAN Food Journal l5 (1) 73-78 (2008) [3] L. M. O. ARRUDA AND M. VITOLO. Characterization of Invertase Entrapped into Calcium Alginate Beads. Department of Biochemical and Pharmaceutical Technology, Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, Av. Prof. Lineu Prestes, 580, B-16, 05508-900, São Paulo, SP, Brazil. Human Press Inc., 1999 [4] Cabral, Joaquim M. S., Aires-Barros, Maria R., e Gama, Miguel. . Lisboa: Lidel, 2003. [5] LEHNINGER, David L. Nelson, Michael M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. 6th edition
η
0,65 0,60 0,55 0,50
0
20
40
60
80
100
[S0] (g/L)
FIG. 6 VARIÇÃO DO FATOR DE EFETIVIDADE GLOBAL COM A CONCENTRAÇÃO INICIAL DE SACAROSE
Apesar de, nesta gama de concentrações, não se ter atingido um factor de efectividade global de um, verifica-se uma tendência nesse sentido, ou seja, que para maiores concentrações de substrato, melhor o factor de efectividade.
C ONCLUSÃO
A partir dos dados obtidos, concluise que a imobilização em alginato de cálcio da levedura S. Bayanus conduziu, com sucesso, à retenção da enzima invertase. Tal foi evidenciado pelo valor de KM do Modelo Michaelis-Menten aumentar relativamente ao valor para a enzima livre, apesar de se ter verificado uma diminuição no parâmetro da velocidade máxima. O uso de biocatalisadores imobilizados a nível industrial deve ser visto como uma estratégia para aumentar a eficiência e redução de custos de produção nos bioprocessos contínuos. Crê-se, portanto, que a produção de açúcares invertidos pode ser realizada a partir da invertase da levedura de champanhe, S. Bayanus, num sistema imobilizado em alginato de cálcio.
