Die bepaling van onbekende proteïenkonsentrasies m.b.v. standaardkurwes en spektrofotometrie

Inleiding:
In hierdie eksperiment is die doel om die konsentrasie van ‘n onbekende proteïenoplossing te bepaal d.m.v. spektrofotometrie, standaardkurwes en die Beer-Lambert wet. Spektrofotometrie is ‘n belangrike komponent in hierdie eksperiment. Dit word gebruik as ‘n analitiese meettegniek om verskeie verbindings te identifiseer deur middel van die verbinding se absorpsiespektrum. Spektrofotometrie word ook gebruik om onbekende konsentrasies van verbindings te bepaal, asook bestudeer spektrofotometrie ensiemreaksies deur die produkvorming of substraatgebruik per tydsinterval te meet. Die spektrofotometer meet die hoeveelheid lig wat ‘n oplossing absorbeer, deur gebruik te maak van monochromatiese lig. Voordat ‘n oplossing se absorpsie-waarde gemeet kan word, moet daar eers ‘n blanko se absorpsiewaarde gemeet word, wat al die vloeistowwe of stowwe bevat, behalwe die substans wat gemeet word. As gevolg van die teenwoordigheid van peptiedbindings in proteïene kan dit maksimaal by 190nm geabsorbeer word. In hierdie eksperiment is daar ook van kleurreagense gebruik gemaak, wat met die proteïene reageer. Die kleurintensiteit van die oplossing kan dan spektrofotometries bepaal word. Die kleurreaksies wat plaasvind is baie sensitief en benodig alkalise pH en Cu2+. ‘n Karakteristieke bloupers kleur ontwikkel a.g.v. ‘n kompleks wat ontwikkel het met die peptiedbindings in die proteïen. Hierdie metodes staan bekend as die Bradford- en Lowry-metodes. Nog ‘n metode wat in hierdie eksperiment gebruik is om die proteïenkonsentrasie te bepaal, is die Beer-Lambert wet. Die wet bepaal dat daar ‘n direkte eweredigheid tussen die konsentrasie van ‘n verbinding in ‘n oplossing en die hoeveelheid lig wat dit absorbeer, ontstaan. Dit wil sê as die twee veranderlikes grafies voorgestel sou word, sal dit ‘n reglynige grafiek vorm. Die wet word voorgestel as: A = εCℓ. Daar is egter geldigheidsvoorwaardes vir die Beer-Lambert wet , wat as volg is: • Dit geld slegs tussen ‘n spesifieke konsentrasie gebied. • Die konsentrasie van die oplossing moenie te hoog wees nie. • Slegs monochromatiese lig. • Aborpsiewaardes geneem by die maksimum golflengte van absorpsie.
Indien drie van die veranderlikes van die bg. vergelyking bekend is, kan enige ander een bereken word.

Metodes en Materiaal
In hierdie eksperiment is ‘n proteïenoplossing met ‘n bekende konsentrasie en een met ‘n onbekende konsentrasie gegee. Die hele doel van die eksperiment is om die onbekende konsentrasie van die proteïenoplossing te kry. Die volledige metode en die materiale wat gebruik is kan in die Biochemie Prakteiese Handleiding verkry word. Du Toit,L. & Foster, E. 2014 . Biochemie 214 Praktiese Notas. Universiteit van Stellenbosch: Departement Biochemie – BIOCHEMIE 214 & 244. (Bl. 34-37).

Resultate

• Eksperiment 1:

Tabel 1: Bereiding van verdunningsreeks vir standaardoplossing:
|Buis nr. |Standaard proteïenoplossing (mL) |Dist. H2O (mL) |
|1 (Blanko) |0,00 |1,00 |
|2 |0,20 |0,80 |
|3 |0,40 |0,60 |
|4 |0,60 |0,40 |
|5 |0,80 |0,20 |
|6 |1,00 |0,00 |

Tabel 2: Aborpsiewaardes en proteïenkonsentrasie vir standaard Proteïenoplossings.
|Buis nr. |Absorpsie by 540 nm |Proteïenkonsentrasie |
| | |mg/mL |
|1 (Blanko) |0 |0.00 |
|2 |0.125 |0.060 |
|3 |0.261 |0.120 |
|4 |0.346 |0.180 |
|5 |0.462 |0.240 |
|6 |0.520 |0.300 |

|Tabel 3: Konsentrasies van standaard proteïenoplossings. |
|Buis nr. |mL Standaard |mg Proteïen |Eindvolume (mL) |
| |proteïenoplossing| | |
|1:1 |1 |1 |2 |
|5X |1 |4 |5 |
|1:9 |1 |9 |10 |
|50X |0,5 |24,5 |25 |
|1:49 |2 |98 |100 |
|200X |0,5 |99,5 |100 |

• Eksperiment 3:

Tabel 5: Aborpsiewaardes vir onbekende proteïenoplossing.
|Buis nr. |Absorpsie-waarde |Verdunnings-faktor |
|7 |2,215 |Onverdun |
|8 |0,079 |200x |
|9 |0,216 |1:49 |
|10 |0,251 |50x |
|11 |0,860 |1:9 |
|12 |1,162 |5x |
|13 |1,60 |1:1 |

Tabel 6: Bepaling van proteïenkonsentrasie van onbekende monster m.b.v. standaardkromme
|Buis nr. |Monster |mg/mL Proteïen vanaf |mg/mL Proteïen in |mg Proteïen in totale volume |mg/mL Proteïen in |
| | |grafiek |buis (6,5 mL) |van verdunning |onverdunde onbekende |
|7 |onverdun | | | | |
|8 |200x |0,03 |0,005 |0,00015 |6,00 |
|9 |1:49 |0,11 |0,017 |0,0022 |5,50 |
|10 |50x |0,13 |0,020 |0,0026 |6,50 |
|11 |1:9 | | | | |
|12 |5x | | | | |
|13 |1:1 | | | | |
| | | | |Gemiddeld: |6,00 |

Tabel 7: Bepaling van proteïenkonsentrasie van onbekende monster m.b.v. Beer-Lambert
|Buis nr. |Monster |A540nm |%m/v Proteïen vanaf |g Proteïen in buis |%m/v Proteïen in |%m/v Proteïen in onverdunde |
| | | |C=A/εℓ | |monster |onbekende |
|7 |Onverdun | | | | | |

Bespreking:
Verdunnings van die standard 0.300 mg/mL proteïenoplossing is gemaak en in kuvette geplaas om die absorpsiewaardes van die verskeie verdunnings te meet, wat in tabel 2 gekry is. Die verdunnings bevat Lowry A en Lowry B kleurreagense. Die gegewe verdunnings word in tabel 1 verkry. Vanaf die absorpsiewaardes in tabel 2, is ‘n standaardkurwe getrek. In figuur 1 word die standaardkurwe wat die absorpsie by 540 nm teenoor die proteïenkonsentrasie vanaf tabel 2 aangetoon. Hierdie standaardkurwe is reglynig, omdat die eksperiment een aan die Beer-Lambert wet voldoen. ‘n Mens sal nie noodwendig altyd ‘n reglynige kromme kry nie, omdat die toestand van die eksperiment nie altyd aan die Beer-Lambert voorwaardes voldoen nie. In tabel 3 word daar berekeninge gedoen om die absorpsiekoëfisiënt (ε) uit te werk ‘n Gemiddeld van 18,93 was verkry. Hierdie absorpsiekoëfisiënt word regdeur al die eksperimente en metodes as ε se waarde gebruik.

In eksperiment 2, tabel 4, is verdunnings van die onbekende proteïenoplossing gemaak. Die verdunningsfaktors en die eindvolumes kan in tabel 4 verkry word. Nadat die die verdunnings met Lowry A en –B kleurreagense gemeng is, is dit in kuvette geplaas en deur middel van ‘n spektrofotometer is die absorpsiewaardes bepaal. Die waardes kan in tabel 5 verkry word. Die absorpsiewaardes van monster tot monster verskil, as gevolg van die aard van verdunning van die spesifike monster. Om die onbekende proteïenoplossing se konsentrasie te bepaal, moet die absorpsiewaardes van tabel 5 vanaf figuur 1 afgelees word. Daar was slegs drie absorpsiewaardes wat in daardie absorpsiewaardes van figuur 1 se reeks ingepas het. Die res se absorpsiewaardes is te hoog. Verder in die bewerkings, is net die drie waardes wat in die standaardkurwe se reeks ingepas het, mee gewerk,. In tabel 6 word die proteïenkonsentrasie van die onbekende monster bereken deur gebruik te maak van figuur 1. ‘n Gemiddeld van 6,00 mg/mL Proteïen is in die onverdunde onbekende verkry. In tabel 7 word die proteïenkonsentrasie van die onbekende monster m.b.v. die Beer-Lambert wet uitgewerk. ‘n Gemiddeld van 0,689 is verkry. Maar die waarde moet omgeskakel word na mg/mL, so dit is 6,89 mg/mL proteïen in onverdunde onbekende. Die gemiddelde wat verkry is in tabel 6 & 7 wyk vanaf mekaar af, omdat die metodes wat gevolg is om dit te verkry, verskil. Faktore soos herhaling van eksperimente, akkuraatheid, nalatigheid ens. Kan ‘n rol speel in die afwyking. ‘n Rede vir die afwyking kon ook wees by die opmaak van die verdunnings, wat nie akkuraat gemeet is nie. ‘n Meer akkurate metode sou die Beer-Lambert wees, omdat daar met ‘n formule gewerk word en die kans vir ‘n fout is minder en dit is meer akkuraat as ‘n skatting. ‘n Nadeel van die standaardkurwe metode is omdat daar vanaf die grafiek af waardes geskat moes word.

Die bekende proteïenoplossing is slegs gegee, sodat dit help om die onbekende proteïenkonsentrasie te kan bereken.
Bronnelys

Blauch, D.N. 2000-2014. AbsorbanceSpectrum. [Intyds] Beskikbaar: http://www.chm.davidson.edu/vce/spectrophotometry/AbsorbanceSpectrum.html [2014, Mei,8]

Du Toit,L. & Foster, E. 2014 . Biochemie 214 Praktiese Notas. Universiteit van Stellenbosch: Departement Biochemie – BIOCHEMIE 214 & 244. (Bl. 34-37).