Kromatografi og spektrofotometri rapport

Formål:
Formålet med øvelsen er at illustrere hvordan planters lysforhold og pigmenter hænger sammen. Ydermere skal kromatografi og spektrofotometri introduceres som biologisk analyse metode.

Teori:
De grønne planter er økosystemets primærproducenter. De har den egenskab at de kan omdanne solens (lys)energi til kemisk energi. Dette bevirker at de kan omdanne uorganiske stoffer til organiske stoffer. Dette gør altså de grønne planter selvforsynende, de er med andre ord fotoautotrofe.
Fotosyntesen ser sådan ud:

6 CO2+12 H2O+lysenergi→C6H12O6+6 O2+6 H2O

Denne kemiske reaktion omdanner kuldioxid og lysenergi til sukker og ilt. Hele denne proces sker inde i plantes kloroplaster (grønkorn).
Selve fotosyntesen kan deles op i to forskellige overordnet processer: Lysprocesserne og mørkeprocesserne(Calvins cyklus)
Figur af de lysnødvendige processer
Figur af de lysnødvendige processer
Lysprocesserne begynder med at lys rammer fotosystem 2, herefter sendes lyset til et klorofylmolekyle, hvorefter lyset beriger en elektron i hvert klorofyl molekyle. Disse beriget elektroner bliver sendt over til et protein ved navn cytokrom-bf. De manglende elektroner i fotosystem 2 bliver nu erstattet ved at der sker en oxidation af vand i Thylakoidets indre. Denne reaktion medføre frie elektroner og O2 gas, hvilket gør det muligt for nye elektroner at blive beriget. O2 er kun et biprodukt af denne reaktion. De beriget elektroner der sendes over til cytokrom-bf bruger deres energi på at pumpe H+ ioner fra stromaen til thylakoidets indre. Dette skaber en koncentrations gradient der bruges til at opretholde funktionen af ATP-synteasen. Denne ATP-syntetase fosforylerer ADP til ATP. Elektronerne bevæger sig nu fra cytokrom-bf proteinet over til fotosystem 1. Elektronerne er dog ikke længere energi-beriget efter at have brugt deres energi på aktiv transport i Cytokrom-bf proteinet. Nu hvor elektronerne befinder sig i fotosystem 1, bliver de endnu engang beriget af lystes energi. Efter elektronerne endnu engang er beriget bliver transporteret over til et nyt protein ved navn NADP reduktase. I dette protein bruges elektronerne til at reducere NADP+ til NADPH.
Dette betyder at når en plante får en stabil mængde sollys over længere tid vil lysprocesserne blive ved med at pumpe ATP og NADPH ud i stromaen. Både ATP og NADPH er nødvendige for at calvin cyklussen kan finde sted.
Calvin cyklussen:
Calvin cyklussen forgår i stromaen og har til formål at omdanne CO2 til kulhydratet G3P. Cyklussen består af 3 forskellige trin: i første trin blive CO2 sat sammen med ribulose-1,5-bifosfat (RuBP). Dette resultere i et 6-kulstofs molekyle, der dele sig til to 3-kulstofs molekyler (glycerat-3-fosfat). Det næste skridt i cyklussen går ud på at benytte noget af det tidligere dannet ATP og elektroner fra NADPH, til at reducere glycerat-3-fosfat til glycerolaldehyd-3-fosfat. I den sidste fase gendannes RuBP, hvorefter den kan bruges i cyklussen endnu en gang. Når cyklusen er kørt igennem 3 gange har man i alt 6 glycerolaldehyd-3-fosfat, 5 af dem bruges til at danne en ny RuBP. Det ene overskydende glycerolaldehyd-3-fosfat molekyle bruges til at danne fruktose-6-fosfat og senere glukose. Der skal 2 glycerolaldehyd-3-fosfat til at danne et fruktose-6-fosfat. Dette resultere så i at calvin cyklussen skal køres igennem 6 gange for at danne et glukose molekyle.
Figur over calvin cyklussen
Figur over calvin cyklussen

Kigger man på hvordan spektrofotometri fungere sker der ved at et lys bliver sendt igennem en væske hvorefter det måles på den anden side, som vist på figuren nedenfor.

Det der måles er forholdet mellem flere forskellige bølgelængders lysintensiteten, på begge sidder af prøveopløsningen. Lysintensiteten måles i Absorbans. Absorbansen defineres også ved denne formel: A=log10(I0I)
Efter selve målingen bliver svaret illustreret som en graf i absorbations-spektrumet (som ses i resultat afsnittet). Dette gør det nemt at se hvilke farver der absorberes og hvilke farver der ikke gør. På farvespektrummet bliver de farver der ligger med høj absorbans absorberet af fotocellen, hvorimod de farver med lav absorbans altså bliver reflekteret af prøveopløsningen og derved skaber prøveopløsningens visuelle farve.

Kromatografi:
Når kemiske stoffer skal adskilles kan man bruge deres opløselighed bruges som et fremragende værktøj. Nogle stoffer er polær (hydrofile) og har derfor let ved at opløse sig i vand. Imens andre ikke har let ved at opløses i vand, men der imod kan opløses i noget upolært (hydrofobt).
Ud fra dette princip fungere Kromatografi. På papiret ses der pigmenter i form af Carotenoider. Carotenoider indeholder kun kulstof og brint og der derfor 100% upolært. Klorofyl A er polært med undtagelse af kulstofhalen der er upolær. Klorofyl B har en ekstra CHO-gruppe og vil derfor vandre langsommere end Klorofyl A.
Den bevægelige fase, der her består af Acetone og petroleumsether 10:90 vol, vil trænge op gennem papiret hvor den vil skubbe de 100% upolær stoffer med sig først, hvorefter de mindre upolær stoffer vil følge efter.
Da vi ved at Carotenoider er 100% upolær burde den gul/røde farve ligge der hvor den bevægelige fase slutter, efterfuldt af Klorofyl A’s grønne farve. Under Klorofyl A burde der ligge endnu en grøn farve der repræsentere klorofyl B.

Fremgangsmåde:

De grønne, gule og røde peberfrugter blendes i hver sin kolbe, hvor efter de overhældes med ethanol. Blandingen står natten over, da ethanolet trækker pigmenterne ud af peberfrugterne, og skaber nogle væsker, i henholdsvis grøn, gul og rød farve.

Spektrofotometri:
De tre forskellige blandinger fra dagen før hældes i tre forskellige kuvetter. Herefter stilles de ned i et kalibreret spektrofotometer, hvorefter spektrofotometrien så kan startes. Efter alle er blevet analyseret opnås nedenstående resultat.

Kromatografi:
Ved kromatografi dryppes en af de 3 væsker på et stykke papir. (I dette forsøg blev den grønne væske brugt.) Væsken tørres og dryppes her efter igen på papiret. Dette gøres indtil man har en stærk gennemtrængende farve.
Når farven er opnået stilles papiret i et glas med 10 % acetone og 90 % petroleumsether, den før nævnte løbevæske. Glasset dækkes nu til og løbe væsken begynder at trænge op gennem papiret.
Efter nogen tid burde farvepigmenterne være adskilt, hvor efter de kan analyseres.

Resultater:

Spektrofotometri:

(rød peberfrugt farvestof) absorbans af y-aksen bølgelængde af x-aksen

Kigger man på resultatet af den røde peberfrugt, ses det at størstedelen af det blå, grønne & gule farve bliver absorberet. Dette efterlader kun den røde farve. I det den røde farve ikke bliver absorberet, må den blive reflekteret. Og altså derfor være den visuelle farve.

(gul/ peberfrugt farvestof) absorbans y-aksen bølgelængde x-aksen

Kigger man på resultatet af den røde peberfrugt, ses det at størstedelen af det blå & grønne farve bliver absorberet. Dette efterlader kun den gule og røde farve. I det den gule farver ikke bliver absorberet, må den blive reflekteret, og altså derfor være den visuelle farve.

(Grøn peberfrugt farvestof) absorbans af y-aksen bølgelængde af x-aksen

Kigger man på resultatet af den grønne peberfrugt, ses det at størstedelen af det blå & røde farve bliver absorberet. Dette efterlader kun den gule/grønne farve tilbage. I det den gule/grønne farver ikke bliver absorberet, må den blive reflekteret, og altså derfor være den visuelle farve.

Kromatografi:
Figur 2.2: undervands-farve-absorbations-skemaet viser hvilke farver der er tilstede på diverse dybder.
Figur 2.2: undervands-farve-absorbations-skemaet viser hvilke farver der er tilstede på diverse dybder.

På ovenstående billede ses resultatet af kromatografien. Øverst ses to gule områder og nedenunder ses der to grønne.

Databehandling:
Undersøges farverne på kromatografipapiret ses det at der nederst er to grønne pletter og over dem er der to gule. Hver af pletterne symboliser et pigment. Alt dette er dog forklaret i teoridelen
Vandplanter er meget anderledes end planter på landjorden.
For at forstå hvorfor der ikke findes grønalger på dybe steder og rødalger på lave steder må undervands-farve-absorbations-skemaet først forstås (se figur 2.2). Figuren viser hvor dybt farver kan gå, før de absorberes af vandet. Tages der først udgangspunkt i rødalgerne, ses det i spektrofotometrien (af en rød peberfrugt) at rødalger reflektere rødt lys, men absorberer store mængder blå og grøn lys, som den kan bruge til at lave fotosyntese. Dette giver rødalgerne mulighed for at befinde sig på dybt vand, da de får en tilpas mængde sollys for at kunne opretholde de lysnødvendige processer. I teorien kunne rødalgerne også befinde sig på lavt vand, men der ville der være større konkurrence om næring og plads. Alene af den grund er det fordelagtigt for rødalgerne at befinde sig på dybt vand.
Undersøgelse af den den grønne alge resultere i den ikke kan befinde sig på samme dybde som rødalgen. Grunden til dette er at grønalgen reflektere grønt lys. Ud fra figur 2.2 ses det at grøn er en af de farver der når lave dybder. Dette betyder at kun lyset fra det blå spektrum ville absorberes af algen hvilket ikke er nok til at opretholde de lysnødvendige processer. Da grønalgen hverken absorbere gul eller violet ret godt, tvinger det algen til at befinde sig på en dybde hvor både rød og orange farver er til stede (0-3 meter).
Ligeledes som grøn og rød-alger evolutionært har tilpasset sig forskellige dybder i havet, har planterne og træerne på landjorden gjort det samme. Tager man fx udgangspunkt i bøgen der er lyselskende træ, ses det at den ikke lukker meget lys igennem sine blade. Grunden til dette er at bladene fordeler sig i mosaik, hvilket resultere i at bladene dækker et meget stort overfladeareal. Bøgetræets store overfladeareal bevirker at der ikke trænger megen lys ned til skovbunden. Dette bevirker også at man ikke ser træer med massere af blade stå under et stort bøgetræ, da det ikke ville få nok sollys. I stedet er der en meget gold jord. Der kan dog være forskellige småplanter og græs, der ikke har behov for meget sollys. Det er dog vigtigt at huske på, at selv om bøgetræet har fået tildelt sig den evolutionære fordel at kunne opfange solens stråler over alle andre planter, har planterne i skovbunden også fået tildelt sig nogle evolutionære fordele. Kigger man fx på det græs under et stort bøgetræ, kan det eventuelt have fået den fordel at den kan absorbere nogle af de bølgelængder som bøgetræet ikke kan, og derved opretholde sine livsnødvendige processer. Den vigtiges egenskab som græsset under bøgen har, er at det er minimalistisk. Dette skal forstås som at græsset ikke har kæmpe blade, lang stilk eller blomst. Græsset kun hvad der er nødvendigt for at opretholde liv.

Fejlkilder:
Kigger man på kromatografi ligner det den gule farve har delt sig i to forskellige pigmenter. Ifølge teorien burde dette ikke være sket da carotenoider er 100% upolær og burde have fuldt løbevæsken til præcision. Grunden til denne fejl kan være to forskellige muligheder. Der kunne være en fejl i opsætningen fx hvis papiret ikke var ordentlig placeret, eller løbevæsken var blandet forkerte etc. Den anden mulighed er at der er et gult pigment i persillen, som vi ikke kender til, og som ikke er 100% upolært .
I spektrofotometrien var der ikke ret meget der kunne gå galt. Så længe spektrofotometeret var kalibreret korrekt, og kuvetten var håndteret med omhu, burde der ikke kunne ske nogle fejl.

Konklusion:
Kigger man på kromatografi forsøget ses det at formålet er opnået. Kromatografien har adskilt de forskellige pigmenter i peberfrugten, hvilket har skabt et visuelt billede af hvilke pigmenter der er tilstede i peberfrugten. Ydermere er kromatografi blevet introduceret som biologiskanalysemetode.
Ser man på resultaterne fra spektrofotometrien ses det hvilke farver der absorberes og hvilke der reflekteres. Dette blev vist med en graf i absorbations-spektrumet. Disse informationer kunne herefter bruges til at bestemme hvorfor rød og grønalger lever på forskellige dybder. Alle disse informationer tilsammen kunne afslutningsvis bruges til at hypotetisere om træers evolutionær egenskaber på land. Her blev der taget udgangspunkt i et bøgetræ og de planter der lever i dens skygge.